Thermisch labile und gegen pH-Schwankungen empfindliche Bioprodukte können nicht immer unter Anwendung von konventionellen Techniken wirksam isoliert werden. So erfolgt die Abtrennung von Penicillin G, eines der wichtigsten Antibiotika, konventionell durch Extraktion aus Fermentationsmedien bei Zugabe von Schwefelsäure im pH-Bereich 1 bis 2. Dabei ist die Säurezugabe bei Abtrennung durch Extraktion der entscheidende Prozessschritt, der Ausbeuteverluste von rund 15 bis 20 Prozent verursacht. So zersetzen sich bei einem pH-Wert von 5,0 in zehn Stunden rund zehn Prozent des eingesetzten Penicillins. Bei wesentlich niedrigeren pH-Werten erfolgt die Zersetzung so schnell, dass eine Messung zu ungenau wird. Das Stabilitätsmaximum von Penicillin G läge bei pH 6,0. Entsprechend wurde nach Techniken gesucht, die eine Arbeitsweise in der Nähe des pH-Stabilitätsoptimums erlauben und somit größere Verluste vermeiden. In diesem Bereich arbeitet die Methode der Reaktivextraktion. Unter Anwendung von Ionenaustauschern, die einen wirksamen Transfer des Wirkstoffs in die organische Phase ermöglichen, erfolgt die Abtrennung dabei schonend in der Nähe des Stabilitätsmaximums von Penicillin G. Die entsprechende Technik ist im Labor-, Technikums- und Pilotmaßstab erprobt. Zunächst hatte man auf anderen Wegen versucht, die vorhandene konventionelle Technik zu verbessern: Um die Zersetzungsgeschwindigkeit herabzusetzen, hat man das penicillinhaltige Kulturmedium vor der Abtrennung drastisch abgekühlt. Die Kontaktzeit der Schwefelsäure mit dem Wirkstoff wurde unter Einsatz von speziellen, dafür entwickelten Apparaten minimiert. Die Produktverluste ließen sich dadurch jedoch nicht entscheidend verringern. Fest stand aber: Eine mögliche Verbesserung des Verfahrens der Penicillinherstellung ist am effektivsten über eine Minimierung der Penicillinverluste während der Aufarbeitung zu erreichen. Bei der Reaktivextraktion handelt es sich nun um ein spezielles Verfahren der Flüssig-Flüssig-Extraktion, mit der empfindliche Bioprodukte schonend abgetrennt werden können. Der Carrier – chemische Bezeichnung: Diisotridecylamin, ein nur in der organischen Phase lösliches sekundäres Amin – wird in der organischen Phase, beispielsweise in Butylacetat, gelöst. Er reagiert in der ersten Stufe an der Phasengrenze mit einem Penicillinanion P - und einem H + -Ion unter Bildung des Komplexes AHP, der nur in der organischen Phase löslich ist. Nach dem Abtransport von AHP zur Phasengrenze 2 zerfällt der Komplex dort beim Kontakt mit OH-Ionen unter Abgabe des Penicillins P - in die wässrige Phase. Wäre eine Extraktion unter diesen schonenden Bedingungen (pH-Wert um 6,0) auch in großem Maßstab möglich, so würden die angesprochenen Produktverluste drastisch herabgesetzt. Eingesetzt wurden zur Optimierung der Extraktionstechnik vorwiegend gängige Anlagen: Extraktionskolonnen wie Karr-Kolonne, gepulste Siebbodenkolonne, Kühniextraktor und eine vierstufige horizontal betriebene Mixer-Settler-Anlage. Um das Extraktionsergebnis weiter zu verbessern, kamen Zentrifugalextraktoren zum Einsatz. Auch hier gab es ein Scale-up unter Verwendung verschiedener Anlagen. Eine Maßstabsvergrößerung wurde unter Einsatz von Tellerseparatoren im Labor- und Technikumsmaßstab erreicht, die ein- bis dreistufig in Gleich- und Gegenstrom betrieben wurden. Das beste Extraktionsergebnis wurde im halbtechnischen Maßstab mit einem Gegenstromextraktionsdekanter unter gleichzeitiger Verbesserung der Verfahrenstechnik erzielt. Mit diesem ließ sich die Zell- und Wirkstoffabtrennung in einem Schritt durchführen, was Zeit und Kosten sparte. Eine weitere Maßstabsvergrößerung ist ohne Weiteres möglich, da diese Anlagen auch parallel eingesetzt werden können. Bei einem zweistufigen Einsatz lässt sich die Klär- und Extraktionswirkung noch weiter verbessern. Die erarbeiteten Grundlagen dieser Prozess- und Verfahrenstechnik lassen sich auch ohne Weiteres auf die Isolierung anderer Bioprodukte übertragen. Der Validierungsaufwand, der bei der Einführung der Technik im GMP-Umfeld entstehen kann, stellt kein Problem dar. Die Technik lässt sich in bestehende Prozesse bei Durchführung entsprechender Risikoanalysen problemlos eingliedern. Durch die Entwicklung eines Gegenstromextraktionsdekanters wurde das Verarbeiten von Flüssigkeiten mit früher unzentrifugierbaren hohen Feststoffanteilen bis zu 60 Vol.-% möglich. Sie arbeiten mit hoher Betriebssicherheit und erlauben einen Einsatz im GMP-Umfeld ohne hohen Validierungsaufwand. Dabei zeigen Versuche mit dem Gegenstromextraktionsdekanter: Der stationäre Zustand ist in diesem in etwa acht Minuten erreicht. Der Extraktionsgrad des Penicillins bei Einsatz eines Carriers beträgt 92 bis 96 Prozent. Zum Vergleich konnten bei einem unter physikalischen Extraktionsbedingungen mit konventioneller Technik durchgeführten Versuch ohne Carrier, bei einem pH-Wert von 5,1, Extraktionsgrade von nur maximal 61 Prozent erreicht werden.Der herausragende Vorteil der Reaktivextraktion liegt somit darin, dass durch den Einsatz von Carriern bei der Aufarbeitung von Penicillin G im pH-Bereich der maximalen Penicillinstabilität die Hydrolyseverluste am Produkt minimiert werden. Die Vorteile, die sich bei der Anwendung der Reaktivextraktionstechnik ergeben, sind:
- Verzicht auf Kühlung des Fermentationsmediums möglich
- Verfahrensschritte Filtration und Waschen des Filterkuchens entfallen
- Extraktion im pH-Bereich maximaler Penicillinstabilität
- Emulsionsbildung bei der Extraktion wird vermieden, sodass die Phasentrennung unproblematisch ist
- Durch hohe Extraktionsgrade günstige Bedingungen für die nachfolgenden Schritte Kristallisation, Ausfällung und Trocknung
Generell ist damit zu rechnen, dass der Einsatz von schonenden reaktiven Techniken unter Einbeziehung von Ionenaustauschern in Zukunft noch mehr an Bedeutung gewinnen wird. Verschiedenste Anwendungen sind denkbar: Ein Beispiel ist die Zentrifugalseparation von Bioprodukten unter Reaktivextraktionsbedingungen bei der Herstellung von Bioprodukten. Ein anderes ist die Abtrennung von niedermolekularen Stoffen aus biologischem Material bei Zell- und Produkt- abtrennung in einem Verfahrensschritt. Möglich ist auch die Abtrennung von höher molekularen Bioprodukten wie bei entsprechender Einbeziehung des pH-Werts und des Isoelektrischen Punkts durch Adsorption und Chromatographie unter reaktiven Bedingungen, die mit der Reaktivextraktion vergleichbar sind.☐
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